PRÁCTICA 9: RECUENTO MANUAL DE PLAQUETAS.

OBJETIVO:

Contar el número de plaquetas presentes en 1mm3 de sangre.

MATERIALES:
Cámara Neubauer

Micropipeta de 20 microlitros.

Cámara Húmeda (en su defecto una placa de Petri con papel de filtro empapado en agua).

Microscopio de contraste de fases (si este no se tiene se usara un microscopio óptico al que se le pondrá en el foco un filtro de luz verde).

Tubo de ensayo

Papel de parafina

Papel de filtro

REACTIVOS:
Liquido diluyente de Rees-Ecker: Contiene citrato sódico, formol, azul cresil brillante y agua destilada), también puede utilizarse Oxalato Amónico al 1%.

MUESTRA:
Sangre capilar o venosa tratada con EDTA.

TÉCNICA:

1. En un tubo de ensayo se depositan 1’98ml de Oxalato Amónico al 1%.
2. Pipeteamos 20 microlitros de sangre, limpiamos la punta de la pipeta y lo depositamos en el tubo de ensayo que contiene el diluyente. Tapamos con papel de parafina y agitamos.
3. Dejamos reposar la mezcla durante 15'.
4. Homogeneizamos la mezcla y llenamos la cámara de Neubauer que pondremos dentro
de la placa de petri a la cual se le ha puesto en el interior un papel de filtro húmedo. Tapamos la placa de petri con la cámara dentro durante 15'.
5. Ponemos sobre el microscopio óptico un filtro de luz verde y comenzamos el recuento con el objetivo de 40x, las plaquetas destacan como puntos negros rodeados de un halo blanco que se distingue si vamos moviendo el tornillo micrométrico.
6. Para el recuento se eligen 4 cuadros situados en ángulos opuestos, de los 4 grandes situados en las esquinas de la cámara. Del tal forma que contaremos 16 cuadritos, lo que es igual que contar un cuadro completo de los grandes que equivale a un volumen de 0’1mm3.

RESULTADOS

Valores normales: 150.000-400.000 plaquetas/mm3

 En mi caso  fueron 180 plaquetas y al multiplicar por 100 : 180.000 plaquetas mm3. Por lo tanto esta dentro de los valores normales.

PRÁCTICA 8: RECUENTO MANUAL DE RETICULOCITOS.

FUNDAMENTO:

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de ARN ribosomial, el cual se tiñe por determinados colorantes llamados "vitales", precipitando y observando unos filamentos citoplasmáticos que no poseen los hematíes. Según el grado de maduración presentan más ó menos filamentos, de forma que a más maduros menos filamentos. Esta práctica se realiza para saber el porcentaje % de reticulocitos que hay circulantes en sangre.

MATERIALES:
Porta y Cubre objetos.

Capilar con heparina.

Microscopio.

Lanceta.

REACTIVOS:
Azul cresil brillante.

MUESTRA:

Sangre entera.

TÉCNICA:
1.Preparación del colorante (nosotros ya lo tenemos preparado).

2. Tinción de reticulocitos: echamos en el tubo de hemólisis 3 gotas de la solución colorante y otras 3 gotas de sangre total previamente homegeneizada.3.Tapamos el tubo de hemólisis y mezclamos suavemente.4.Introducimos en el baño maría a 37ºC durante 5 minutos. Cuando pase ese tiempo, volvemos a homogeneizar.5.Cogemos una gota, la colocamos sobre el porta y realizamos la extensión. Dejamos secar al aire.

RESULTADOS:

Los eritrocitos y reticulocitos se observan de color verdoso, presentando estos últimos el retículo ó precipitado de ARN en tono azul oscuro. A veces el recuento se realiza en dos extensiones para una mayor exactitud de resultados.

En la primera extensión hemos encontrado 6 reticulocitos que equivale a 0’6% y en la segunda hemos visto 8 que equivale a un 0’8%, por lo que podemos decir que los resultados están dentro de lo normal pues tienen que estar entre un 0’5% y un 1’5%.

PRÁCTICA 7: FÓRMULA LEUCOCITARIA.

FUNDAMENTO:

La formula leucocitaria es el recuento diferencial de cada uno de los leucocitos presentes en la sangre periférica.
Proporciona información sobre el estado de las células de la sangre, así como de la eventual presencia, en la misma, de células que en condiciones normales no deben estar presentes (Blastos, mielocitos, células plasmáticas, linfocitos reactivos, eritroblastos y otros).

MATERIALES:
Microscopio.

MUESTRA:

Extensión fijada y teñida mediante coloración panóptico rápido.

TÉCNICA:

Para realizar la fórmula el objetivo de inmersión 100X
1.Se realiza en el "Cuerpo" del frotis, zona situada entre la cabeza y la cola, en donde las células se observan en toda su superficie y sin artefactos, se puede apreciar tanto el tamaño como la forma.

2. Se cuentan todos los leucocitos que aparezcan clasificándolos al mismo tiempo por sus
diferentes tipos hasta un total de 100.

RESULTADOS:

BASÓFILOS :1

EÓSINOFILOS:1

MONOCITOS :2

LINFOCITOS: 20

LEUCOCITOS CAYADOS : 10

LEUCOCITOS SEGMENTADOS :28

PRÁCTICA 6: RECUENTO MANUAL DE LEUCOCITOS.

FUNDAMENTO:

Consiste en hacer el recuento en una dilución de sangre entera anticoagulada. Es un método poco usado debido al elevado error que presenta. La técnica consiste en diluir sangre anticoagulada con EDTA, en líquido de Turck y el recuento de las células mediante hemocitómetro o cámara de recuento utilizando un microscopio óptico. Para calcular el valor total de recuento tendremos en cuenta la dilución utilizada, el área contada y la altura de la cámara utilizada.

MATERIALES:
Microscopio.

Cámara de Neubauer.

Pipetas de 20 ul y puntas.

Lanceta.

REACTIVOS:

Liquido de turk: Cuya composición es la siguiente: 2 ml de ácido acético glacial, 1 ml de solución acuosa de violeta de genciana al 1 %  y 100 ml de agua destilada.

MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA.

TÉCNICA:

1. Preparar un tubo de ensayo con 0,38 ml de líquido de Turck.
2. Con una micropipeta de 20μl, pipetear la sangre, limpiar la sangre adherida en la parte exterior de la punta con una gasa o papel de filtro sin arrastrar sangre del interior y ponerla en el tubo de ensayo con el diluyente. Lavar varias veces con diluyente el interior de la punta de pipeta para arrastrar bien la sangre. De ésta manera hemos efectuado una dilución al 1/20. 

3.Tapar el tubo de ensayo con papel de parafina y se mezcla suavemente.

4. Llenar la cámara por capilaridad.

5. Dejar que repose durante 5', para que sedimenten los leucocitos.

6. Con el objetivo de 10x enfocar, con el de 20x se observa la distribución de las células (Si no están uniformemente distribuidos debemos repetir la técnica).

7. Enfocar con 40x. Contar los leucocitos presentes en 16 cuadros, de los 4 cuadros grandes situados en las esquinas de la cámara.

8. Para ello se empieza por el cuadrado de la parte superior izquierda, realizando el recuento del mismo modo que se hace para hematíes.

9. No contar partículas extrañas ni pequeñas burbujas. Para realizar un recuento correcto y no contar leucocitos por segunda vez, si existen células sobre los bordes exteriores de un cuadrado, se cuentan solo aquellos situados sobre las líneas superior e izquierda.

10. Una vez contados los 4 cuadrados grandes de las esquinas de la cámara, se suman todos los leucocitos contados en ellos para obtener el total de células observadas.

11. Calcular la cifra de leucocitos de la muestra (expresado en leucocitos por mm3 de sangre) teniendo en cuenta la dilución realizada y el volumen de los cuadros.

RESULTADOS:

En el primer cuadrado hay 29 leucocitos

En el segundo cuadrado hay 35leucocitos.

En el tercer cuadrado hay 32leucocitos.

En el cuarto cuadrado hay 39 leucocitos.

Para calcular los leucocitos que hay en la sangre diluida por mm³, vamos a utilizar la siguiente fórmula:

(Ltotales1 + Ltotales2 + Ltotales3 + Ltotales4) X 50

Solución: 6750 mm3

Práctica 5: Recuento de hematíes.

·         Objetivo:

Se basa en la dilución de la sangre total capilar o anticoagulada con EDTA, en líquido de Hayem. Vamos a calcular el valor total de recuento de hematíes y para ello tendremos en cuenta el área contada, la dilución utilizada y la altura de la cámara utilizada. Al igual que ocurre en el recuento de leucocitos este es un método poco usado debido al elevado nivel de error que presenta.

·         Materiales y reactivos:

- Microscopio
- Pipeta de 20 µl
- Cámara de Neubauer y cubrecámara
- Sangra anticoagulada
- Papel de filtro
- Lancetas

 -Líquido diluyente Hayem, el cual contiene cloruro sódico para que sean isotónicos y evitar hemólisis, e incorpora citrato sódico como anticoagulante y un antiséptico como la formalina.
- Tubo de ensayo
- Gradilla
- Puntas de pipeta

·         Ténica:

1. Primeramente vamos a preparar un tubo de ensayo  con 4 ml de líquido de Hayem y lo depositamos en un tubo de ensayo.

2. Procedemos a la punción capilar con la lanceta en la yema del dedo. Luego con la micropipeta de 20 microlitos, pipeteamos la sangre, limpiamos la sangre adherida en la parte exterior de la punta con una gasa sin arrastrar la sangre del interior y ponemos en el tubo de ensayo con el dilyente. En la parte superior del tubo de lava varias veces con diluyente el interior de la punta de pipeta para arrastrar bien la sangre.

3. A continuación, tapamos el tubo de ensayo con papel de parafina y homogeneizamos lentamente la muestra por el inversión 

4. Montamos la cámara, colocamos el cubrecámara.

5.Vamos a llenar uno de los retículos de cámara por un pequeño hueco que hemos dejado para que, con ayuda de la micropipeta, se llene por capilaridad. (Debe de llenarse de forma que el líquido ocupe toda la superficie).

6. Una vez que la cámara está montada, tenemos que dejarla reposar unos 3 minutos para que los hematíes que están suspendidos, sedimenten y se pueda proceder de manera correcta al recuento.

7. Procedemos a la observación a través del microscopio, con el objetivo de 10x enfocamos y con el de 20x observamos la distribución de las células. (Si no están uniformemente distribuidos debemos repetir la técnica)

8. Para hacer el recuento de hematíes lo haremos con el objetivo de 40x.

 Recuento de hematíes

El recuento de hematíes se va a hacer en el cuadrado central, pero solo en los cuadrados de las cuatro esquinas y en central. Cada cuadrado mediano (del central) que vamos a contar tiene 16 cuadrados pequeños.

¿  En qué sentido se cuentan los hematies?

RESULTADOS:

En el primer cuadrado hay 90 hematíes

En el segundo cuadrado hay 78 hematíes

En el central hay 75 hematíes

En el tercer cuadrado hay 80 hematíes

En el cuarto cuadrado hay 79 hematíes

Para calcular los hematíes que hay en la sangre diluida por mm³, vamos a utilizar la siguiente fórmula:(Htotal1 + Htotal2 + Htotal3 + Htotal4 + Htotal5) X 10000.

SOLUCIÓN:  4.020000 mm3

PRÁCTICA 4: MICROHEMATOCRITO MANUAL.

OBJETIVO:
Se basa en sedimentar los hematíes de un volumen sanguíneo determinado mediante la fuerza centrífuga y medir el volumen que ocupan.

FUNDAMENTO:
El hematocrito es el volumen que ocupan los hematíes con respecto al volumen total de sangre. Se expresa en %, es decir cm3 o ml de hematíes que hay en 100 cm3 de sangre.

MATERIALES:
Plastilina

Centrífuga de hematocrito

Regla milimetrada

Capilar desechable

MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA.

TÉCNICA:

1. Con una lanceta puncionamos en un dedo, que previamente ha sido desinfectado con alcohol y masajeado para aumentar el flujo de sangre. A continuación, ponemos el tubo capilar en contacto con la sangre hasta que se llene por capilaridad 3/4 partes y  después hacemos lo mismo con un 2º tubo y con la misma sangre, ya que la determinación se realiza por duplicado.En nuestro caso lo hemos realizar con sangre venosa que teníamos reservada, aunque lleve tiempo ya guardada. Según el tipo de sangre, vamos a utilizar un capilar u otro, en nuestro caso utilizamos el de la franja azul (ya que es sangre venosa).

 2. Taponamos el extremo del capilar más próximo a la sangre con plastilina.

3. Colocamos los dos tubos en posición opuesta una del otro en los surcos radiales del plato de la centrífuga, de forma que el extremo sellado con plastilina quede en la parte exterior.

4. Cerramos la tapa de la centrífuga, ajustamos la velocidad a 15.000 rpm durante unos 5 minutos.

5. La capa de color gris que aparece entre los hematíes y el plasma está formada por leucocitos y plaquetas. La aparición de un plasma de color naranja o verdoso sugiere un aumento de la bilirrubina en sangre, mientras que si el color es rojo sugiera la presencia de hemoglobinemia.

muestra

capilar tapado con plastilina

plato de la centifuga

El plasma aparece como con un tono rojizo, debido a la hemolisis de los hematíes ya que esa sangre tenia unas cuantas semanas.

Medicción.

-total : 5,8 y 2,8 --- muestra 1        hematocrito 1 :40%

-total: 5,4 y 2,5 ----- muestra 2       hematocrito 2: 43%

En mi caso esta dentro de los valores normales

PRÁCTICA 3:TINCIÓN DE AZUL CRESÍL BRILLANTE PARA RETICULOCITOS.

OBJETIVO:

Se realiza para la observación de orgánulos celulares y restos de ARN.

FUNDAMENTO:

Los reticulocitos son hematíes inmaduros que conservan algunos orgánulos celulares y restos de ARN. Se disponen formando una sustancia reticular granulofilamentosa intracitoplásmatica ,que se tiñe de manera específica con el azul de cresil brillante.

MATERIALES:
Tubos de hemólisis.

Portaobjetos.

Baño termostático

REACTIVOS:

Azul cresil brillante.

MUESTRA:
Sangre anticoagulada con EDTA.

TÉCNICA:
1.Introducir en un tubo de hemólisis cantidades iguales de de la solución colorante (azul cresil brillante) y de sangre periférica anticoagulada con EDTA. Mezclar suavemente y cerrar el tubo con parafilm para evitar la desecación.
2. Incubar 5 minutos en el baño a 37ºC.
3. Homogenizar suavemente la mezcla, depositar una gota sobre un portaobjetos limpio y realizar una extensión, que se deja secar al aire.

IMÁGENES

PRÁCTICA 2 : TINCIONES POLICROMAS

OBJETIVO:

Tiene por objetivo aumentar en contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean visualizadas microscópicamente con mayor facilidad, utilizando una combinación de colores, para de esta forma obtener una tinción policroma (varios colores).

FUNDAMENTO:

Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas. Es una tinción de tipo no vital, en ella las células están muertas y su coloración requiere un proceso de fijación previo que normalmente se realiza con etanol o metanol.

TINCIÓN DE MAY-GRUNDWAL-GIEMSA:

MATERIALES:

Agua destilada

Cristalizador

Paralela

Pipeta Pasteur

Tubo de ensayo

Gradilla

Lanceta

REACTIVOS:

Solución de May-Grundwal

Colorante Giemsa

MUESTRA:

Frotis sanguíneo.

TÉCNICA:

1. Primero, con ayuda de una lanceta pinchamos  en la yema de los dedos , colocando una gota de sangre sobre un porta hacemos una extensión sanguínea. Una vez que la tenemos, la dejamos secar al aire.

2.Colocamos el frotis sanguíneo secado al aire sobre la paralela y la cubrimos (usando la pipeta Pasteur) con la solución de May-Grunwal, dejándola actuar durante 3 minutos.

3. Pasados los 3 minutos, sin quitar el colorante vamos a diluir, añadiendo sobre él la misma cantidad de agua destilada que la que habíamos añadido de colorante. Debemos procurar que este no se vierta. Dejamos actuar durante 5 minutos.

4. Preparamos una dilución en un tubo de ensayo que contenga, 5 ml de agua destilada y 5 gotas de colorante Giemsa. Tapamos con parafina y homogeneizamos bien.

5. Inclinamos el porta para que se vierta y escurra el colorante. Y seguidamente, sin lavar, cubrimos el porta con la solución de Giemsa diluida. Dejamos actuar durante 15 minutos.

6. Finalmente, lavamos con abundante agua destilada y dejamos que se seque totalmente al aire.

7. Una vez lista, podemos observar al microscopio. Utilizamos también el objetivo de 100x.

TINCIÓN PANÓPTICO RÁPIDO:

MATERIALES:

Agua destilada

Pinzas

Lanceta

REACTIVOS:

-Tres cubetas de Wertheim:

Solución 1: Metanol (fijador)

Solución 2: Santeño (ácido)

Solución 3: Tiacina (básico)

MUESTRA:

Frotis sanguíneo.

TÉCNICA:

1. Pinchamos la yema del dedo y colocando la gota de sangre en el porta, hacemos la extensión sanguínea. Dejamos que se seque la muestra.

2. Se colocan las tres soluciones en las cubetas de Wertheim, una cubeta para cada solución.

 3. Cogemos los portas con las pinzas y los sumergimos 5 veces (metiendo y sacando rápido) en la solución 1, se escurre y se procede a hacer lo mismo en las soluciones 2 y 3.

4. Una vez que lo sacamos de la solución 3 y lo escurrimos, se lava con agua destilada y se deja secar.

5. Cuando esté seco totalmente procedemos a su observación al microscopio.

IMÁGENES DE LA TECNICA

Por ultimo miramos los resultados

TINCIÓN DE WRIGHT:

MATERIALES:

Lanceta

Agua destilada

Cristalizador

Paralela

Pipeta Pasteur

REACTIVOS:

Solución de Wright

MUESTRA:

Frotis sanguíneo.

TÉCNICA:
1. Pinchamos la yema del dedo y colocando la gota de sangre en el porta, hacemos la extensión sanguíneas. Dejamos que se seque la muestra.

2. En esta tinción tampoco es necesario fijar la muestra con alcohol de metileno, ya que el propio colorante va en solución alcohólica. Ponemos el porta sobre la paralela y lo cubrimos con la solución de Wright. Dejamos que actúe uno o dos minutos.

3. Una vez que ha actuado la solución de Wright, le añadimos la misma cantidad de agua destilada sin quitar el colorante, debemos procurar que no se vierta. Dejamos actuar durante 4 o 5 minutos.

4. Lavar la extensión con agua destilada hasta que la muestra tome un color rosado. NO se debe volcar el portaobjetos para eliminar el colorante antes de lavarlo bien con agua para evitar que se deposite sobre la preparación quedando restos de él.

5. Dejar que se seque totalmente al aire.

6. Una vez seca, proceder a la observación al microscopio, usando el objetivo de 100x.

IMÁGENES DE LA TECNICA

RESULTADOS:

PRÁCTICA 1 : FROTIS SANGUÍNEO.

OBJETIVO:

Aprender a realizar extensiones sanguíneas.

FUNDAMENTO:

Una extensión ó frotis sanguíneo consiste en recubrir parcialmente un portaobjetos con una gota de sangre de tal manera que las células de ésta se dispongan formando una sola capa de ellas.Es una técnica muy utilizada en hematología que nos permite obtener una información para el estudio de la morfología de las células.El anticoagulante de elección es el EDTA. 

MATERIALES:

Portaobjetos

Capilares

MUESTRA:

Sangre.

TÉCNICA:
1.Se preparan dos portas de cristal limpio y desengrasado, uno de ellos normal y el otro esmerilado y biselado.

2. Homogeneizar la sangre.

3.Llenamos un capilar con la sangre y dando unos golpecitos en el porta depositamos una pequeña gota de sangre sobre la línea central

4. Con el porta esmerilado se hace contacto con la gota manteniendo una inclinación de unos 45º y llevándolo hacia atrás, la sangre alcanza por capilaridad todo el ancho del porta.
55. Se arrastrará con movimiento uniforme y a una velocidad media por todo el porta donde se depositó la sangre. Una buena extensión debe de tener entre 3 y 4 cm de longitud.

6. Una vez hemos realizado el frotis se deja secar a temperatura ambiente y en posición horizontal

¿Como se procede a un frotis?

¿Como no debe hacerse un frotis?

Forma correcta de un frotis y partes