PRÁCTICA Nº 25: TSH



Objetivos:

Determinar cuantativamente la hormona estimulante del tiroides (TSH)


MATERIALES:

• Lector de placas microtitter
• Agua
• Pipetas

REACTIVOS

• Placa de micropocillos cubiertos con Ac monoclonal murino anti- TSH.
• Set de patrones liofilizados: 0,0,1,0,5,2,5y 10     
• Conjugado enzimático (13mL)
• Sustrato TMB (11 mL)                                        
• Solución de parada: HCl 1 N (11 mL)
  
  

MUESTRA

• Suero

TÉCNICA:
1. Pipetear 100 μL de los patrones, del control y de la muestra en los pocillos correspondientes.
2. Agregar 100 μL de conjugado en cada pocillo
3. Mezclar agitando al menos durante 30 segundos.

4. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
5. Volcar el contenido de los pocillos.
6. Lavar los pocillos con agua destilada hasta llenarlos. Repetir el lavado cinco veces.
7. Tras el último lavado, eliminar el contenido de agua de los pocillos sacudiéndolos contra un papel absorbente.
8. Agregar 100 μL de solución TMB (sustrato cromogénico). El color vira a azul.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
10. Detener la reacción añadiendo 100 μL de solución de parada
11. Mezclar con cuidado durante 30 segundos. El color vira completamente a amarillo.

12. Determinar la absorbancia a 450 nm con un lector de micropocillos durante los 15 minutos siguientes.

RESULTADOS: 

PRÁCTICA Nº 24:TEST DE DROGAS

FUNDAMENTO:

Los test rápidos nal von minden Drug-Screen son inmunoensayos competitivos para la determinación cualitativa de varias drogas y sus metabolitos en orina humana.

MATERIALES:

Test nal von minden Drug-Screen

MUESTRA:

Orina

TÉCNICA:
1. Dejar que las muestras alcancen la Tª ambiente antes de ser testadas.

2.Sumergir la tira en la orina durante aproximadamente 15-30 segundos. La zona de plástico no debe entrar en contacto con la orina.

3.Esperar aproximadamente 5 minutos antes de leer los resultados. No interpretar los resultados pasados 10 minutos (pueden aparecer falsos positivos).

RESULTADOS:

      

Interpretación de resultados:

La zona de test (T) detecta las drogas que puedan encontrarse en la muestra de orina. La otra es la zona de control (C).

- Cuando el resultado es negativo (muestra libre de drogas), una línea rosa aparecerá tanto en la zona de test (T) como en la zona de control (C).

- Cuando el resultado es positivo solo aparecerá una línea rosa en la zona de control (C).

Si en la zona de control no puede distinguirse claramente la línea rosa, el test es inválido.

PRÁCTICA Nº 23: SEMINOGRAMA

FUNDAMENTO:

El seminograma está indicado para valorar la capacidad reproductora de un varón. También en un estudio post-vasectomía, con la intención de comprobar si los espermatozoides han desaparecido totalmente del eyaculado.

MATERIALES:

Probeta o tubo de ensayo graduado

Papel indicador de pH

Portaobjetos y cubreobjetos

Pipetas Pasteur

Varilla de vidrio

Cámara de Neubauer

Baño termostático

Microscopio

Estufa

Cámara húmeda

REACTIVOS:

Eosina azulada al 1% en agua destilada

Nigrosina al 10% en agua destilada o SSF

Formol al 40%

Bicarbonato sódico

Colorante panóptico rápido o Giemsa

Metanol

Sperm-Mar test

MUESTRA:

Semen

TÉCNICA:

Licuación:

Se realiza por observación, manteniendo la muestra en el baño a 37ºC.

Un aumento del tiempo de licuación hace difícil la fecundación, en cambio, una disminución puede orientar hacia procesos inflamatorios de próstata y vesículas seminales.

Volumen:

Medimos el volumen en probeta o en un tubo de ensayo graduado (precalentados a 37ºC). 

En condiciones normales oscila entre 1.5 mL-6mL.

Color:

Se realiza por observación de la muestra. 

Varía del blanco-opalescente al blanco-amarillento.

Un color claramente amarillento puede deberse a la existencia de pus (piospermia), bilirrubina (ictericia) u observarse después de una abstinencia sexual prolongada. 

Un color rojizo se asocia a la presencia de sangre (hemospermia). 

Un aspecto más o menos transparente puede indicar oligospermia o azoospermia.

Viscosidad: 

Tomamos un poco de la muestra con una pipeta Pasteur y vemos  como gotea la muestra. Normalmente cae gota a gota, o bien formando hilos cortos.

En caso de que caiga en forma de hilo largo, diríamos que la viscosidad está aumentada. Esto puede dificultar el movimiento de los espermatozoides y por lo tanto, el proceso de fecundación.

Una viscosidad disminuida puede asociarse a oligospermia.

Para averiguarla nos ayudamos  de una varilla de vidrio, la introducimos en la muestra y se forma un filamento de 5-10 mm.

PH: 

Con ayuda de tiras de papel indicador, dejamos caer una gota sobre ellas, esperamos unos segundo e interpretamos el color comparándolo con la leyenda de colores del envase. 

Varía entre 7.2 y 8.5.

Valores ácidos indica el predominio de secreciones prostáticas.

EXAMEN MACROSCÓPICO:

Movilidad:

Colocar una gota de semen sobre un portaobjetos previamente precalentado a 37ºC, colocar el cubreobjetos procurando que no se formen burbujas y observar al microscopio con objetivo seco de x40.

Se determina el porcentaje de espermatozoides móviles y sus distintos tipos de movilidad:

Se puede determinar dando el porcentaje de:

Progresivos (%):65%

No progresivos (%):20%

Inmóviles (%):15%

Lo normal es encontrar al menos un 32% de espermatozoides con movimiento progresivo o con un 40% de espermatozoides móviles.

Vitalidad: Prueba eosina-nigrosina. 

Consiste en mezclar 50µL el semen con 50µL de eosina azulada al 1% en agua, esperamos 20-30 segundos y añadimos 100µL de nigrosina al 10% en agua.

A continuación, agitamos y hacemos una extensión a lo largo de todo el porta (debe de ser fina). 

Observamos al microscopio con el objetivo x100.

Los espermatozoides muertos adquirirán una coloración rosada (debido a que su membrana está alterada).

Los espermatozoides vivos quedarán sin teñir.

Para considerar una muestra normal, deben estar vivos (sin teñir) más del 58% de los espermatozoides.

Recuento: 

Se diluye la muestra con la solución de Macomber-Saunders:

En casos de oligospermia, el semen no se diluye.

A continuación, se carga la cámara de Neubauer con semen diluido al 1/21 con la solución anterior, se deja reposar 2 minutos en cámara húmeda y se observa al microscopio con el objetivo x40. 

El recuento se hace en el retículo correspondiente a una de las esquinas.

Número de espermatozoides contados =180

Multiplicamos:

Nº espermatozoides x dilución x 10.000 = 180 x 21 x 10.000 = 16.800.000 espermatozoides/mL

Lo normal es obtener valores superiores a 39 millones por eyaculado.

Morfología:

Realizamos una extensión sobre el portaobjetos con una gota de semen y dejamos que seque al aire perfectamente. Posteriormente fijamos con metanol durante 5 minutos, renovando el alcohol cada minuto y medio. NUNCA debemos fijar con calor. A continuación, teñimos con panóptico rápido. 

Dejamos secar la tinción y observamos al microscopio con el objetivo x100.

Debemos observar al menos 200 espermatozoides, fijándonos en la forma de su cabeza, cuello y cola y observando si existen células inmaduras o deformes. 

Espermatozoides normales: 16%

Espermatozoides anormales: 9%

Según la OMS puede aceptarse como normal todo semen que estuviera por encima del 14% en formas morfológicamente normales.

RESULTADOS:

  VITALIDAD. LOS MUERTOS SE TIÑEN DE ROJO PUSTO QUE LA MEMBRANA ESTA DEBILITADA Y PERIMITE QUE EL COLORANTE ENTE EN EL INTERIOR.

PRÁCTICA Nº 22: ESTUDIO DE DIGESTIÓN DE PRINCIPIOS INMEDIATOS EN HECES.

Objetivo

Este examen microscópico es de gran ayuda en el diagnóstico de los distintos tipos de patologías relacionadas con el proceso de la digestión.

Materiales:

- Tubo de plástico desechable

- Espátula 

- Portaobjetos y cubreobjetos

- Microscopio óptico

- Mechero

- Reactivos:

   -  Solución de Lugol diluido a 1/3 con agua destilada

  - Solución alcohólica de Sudán III (0.5g Sudán III + 45 mL etanol 96º. Calentar y dejar enfriar.     Filtar)

- Solución de Sudán con ácido acético (0.2g Sudán III + 10 mL etanol 96º + 90 mL ácido acético. FIltrar si es necesario)

 - Agua destilada

Muestra

Heces

Técnica:

1. En un tubo de ensayo de plástico depositamos una pequeña cantidad de las heces con la espátula y la homogeneizamos con la misa cantidad de agua destilada aproximadamente.

2. Tomamos una gota de esta papilla y la depositamos en un porta junto con dos gotas de lugol. Tapamos con un cubreobjetos y observamos al microscopio con un objetivo seco.

3. Tomamos otra gota de la papilla y la depositamos en un porta con dos o tres gotas de Sudán III. Tapamos con un cubre y calentamos suavemente sobre la llama del mechero hasta que hierva. Observamos la preparación en caliente con un objetivo seco.

4. Tomamos otra gota de la papilla y le añadimos dos o tres gotas de la solución de Sudán III con ácido acético. Tapamos con un cubre y calentamos suavemente con la llama del mechero. Observamos al microscopio con un objetivo seco. 

• Resultados:

- En el porta con lugol observaremos el estado de digestión de los hidratos de carbono y de las proteínas. 

- En el porta caliente con solución de Sudán III podemos observar la presencia de grasas neutras y ácidos grasos, que se tiñen de rojo y aparecen como glóbulos de color rojo-anaranjado, que se transforman es espículas a medida que se enfría la preparación. En caso de mala digestión, se observará un gran número.

- En el porta caliente con solución de Sudán III y ácido acético observaremos la presencia de jabones, que se verán como agujas o cristales afilados.

Fibra muscular bien digerida

Grano de almidón

• Significado clínico: en las heces podemos observar el grado de digestión de los distintos principios inmediatos.

PRÁCTICA Nº21 SANGRE OCULTA EN HECES.

Objetivo

 Este test (NADAL FOB) es un inmunoensayo visual rápido para la detección cualitativa de hemoglobina humana en muestras fecales.

Materiales:

- 1 test NADAL FOB

- Cronómetro

- Recolector de heces

- Hoja para el paciente con información sobre la recolección de la muestra

- Recipiente para la recolección de la muestra

¿En qué se basa este test NADAL FOB?

  

Este test está especialmente diseñado para detectar la hemoglobina humana en muestras fecales, a través de la interpretación visual del cambio de color en el test.

Técnica:

1. Sujetar el tubo verticalmente y abrir el tapón azul. Extraer el aplicador
2. Recolectar la muestra introduciendo el aplicador en tres puntos diferentes de las heces.

3. Insertar el aplicador con la muestra otra vez en el tubo y cerrar bien el tapón.
4. Agitar bien el tubo de recolección para que la muestra se mezcle completamente con el búfer diluyente.

Procedimiento del test:

1. Llevar el test y la muestra del paciente a Tª ambiente.

2. Sacar el dispositivo de su envoltorio y colocarlo sobre una superficie limpia y plana. Para mejores resultados, se recomienda realizar la prueba en el intervalo de una hora.

3. Agitar bien el tubo para mezclar totalmente la muestra fecal con la solución.

4. Desenroscar la tapa protectora del tubo de recolección. Romper la punta del dispositivo mediante un movimiento giratorio utilizando un pañuelo de papel.

5. Mantener le tubo recolector de forma vertical y añadir 3 gotas de la solución en el pocillo de la prueba "S". Evitar la formación de burbujas.

6. Interpretar el resultado a los 5 minutos. No interpretarlos a los 10 minutos porque pueden dar falsos positivos.

Resultados:

El test de la izquierda: negativo
El test de la derecha: positivo

-Significado clínico: Este test ha sido diseñado para ayudar al diagnóstico profesional de enfermedades de enfermedades en el intestino grueso.

El cáncer de cólon es uno de los tipos de cáncer más frecuentemente diagnosticados y aparece como la principal causa de muerte por cáncer. La detección de sangre oculta en heces aumenta las probabilidades de un diagnóstico en las primeras etapas, conllevando una reducción de la mortalidad. 

PRÁCTICA 20: TÉCNICA DE FEHLING’S.

OBJETIVO:

Utilizando el método de Fehling´s vamos a determinar la presencia de glucosa en orina.

MATERIALES:

Tubos de vidrio

Pipetas automáticas

Mechero

REACTIVOS:

Reactivo A

Reactivo B

MUESTRA:

Orina

TÉCNICA:

Tomar la orina que se quiere analizar (3 ml)

Añadir 1 ml de Fehling A y 1 ml de Fehling B. El líquido del tubo de ensayo adquirirá un fuerte color azul.

Calentar el tubo al baño María o directamente en un mechero.

RESULTADOS:

 

CUANDO HAY GLUCOSA VIRA A ROJO LADRILLO Y ES +

CUANDO NO HAY GLUCOSA NO VIRA SE QUEDA DE COLOR AZULADO VERDOSO.

PRÁCTICA Nº 19 OBSERVACIÓN DEL SEDIMENTO URINARIO

OBJETIVO:

Observar una muestra de sedimento urinario los diferentes cristales, cilindros y células que puedan aparecer.

MATERIALES:

Tiras reactivas para análisis de orina

Lector de tiras reactivas, o en su defecto interpretarlas utilizando la leyenda de cada bote

Centrifugadora

Porta

Pipetas Pasteur

Cubreobjetos

Microscopio

MUESTRA:

Orina

TÉCNICA:

Una vez obtenida la muestra de orina, comprobar pH y posibles problemas con las tiras reactivas, realizando esta lectura con el lector de tiras.

Pasamos una cantidad de muestra de orina a tubos de centrífuga de 10 mL.

Centrifugar durante 5 minutos.

Procedemos a decantar la muestra obtenida (dejando aproximadamente 0.5-1 cm de sedimento).

Preparar la observación: en un porta depositar una gota del sedimento (previamente resuspendido) y colocar encima el cubreobjetos.

Finalmente proceder a la observación de la preparación. Utilizando los objetivos 10x y 40x.

LECTOR DE TIRAS REACTIVAS:

RESULTADOS :