Fundamento.
La electroforesis de la hemoglobina es una técnica muy sencilla que permite detectar las anomalías tanto cualitativas como cuantitativas , la separación de las hemoglobinas se basa en las propiedades de la carga eléctrica de la globina .
La globina presenta una carga global positiva o negativa que resulta de la suma de las cargas de los aminoácidos que constituyen la proteína.
Objetivo.
El objetivo de la práctica es realizar una electroforesis con tiras de cellogel mediante un hemolizado.
Materiales y reactivos.
-Material de electroforesis .
-Cloroformo .
- Tampón tris-glicocola.
-Colorante negro amido .
-Colorante rojo Ponceau .
-Decolorante negro amido y rojo Ponceau.
-Solución transparentadora A y B.
-Solución disolvente (ácido acético 80 % ).
-Muestra de sangre anticoagulada con EDTA.
Procedimiento.
-En primer lugar realizaremos el hemolizado : centrifugaremos a 3.000 rpm durante 5 minutos , eliminamos el plasma , volvemos a resuspender los glóbulos rojos con 4-5 l de suero fisiológico y agitamos. Volvemos a centrifugar durante 5 minutos (repetiremos este paso 4 veces). A continuación , se hemolizan los hematíes en un tubo de vidrio mezclando 1 volumen de globulos rojos con 1.5 volúmenes de agua destilada junto con 0.5 volúmenes de cloroformo . Agitamos fuertemente y centrifugamos 20 minutos a 3.000 rpm
El sobrenadante es el hemolizado que se emplea en la técnica .
-En segundo lugar prepararemos la electroforesis
Sumergimos las tiras en tampón durante 10 minutos.
Absorbemos el exceso de tampón entre 2 hojas de papel de filtro.
Colocar la tira en el puente con la cara absorbente hacia arriba y la esquina cortada hacia la derecha y abajo.
Realizar la migración a 90 minutos a 200 volts efectuando la aplicación de la muestra a 1.5 cm del borde catódico.
-En tercer lugar realizaremos la coloración sumergiendo la tira en el colorante rojo Ponceau durante 10 minutos.
-En cuarto lugar , decoloramos mediante 3 o 4 baños en el decolorante hasta obtener un fondo completamente blanco.
-En quinto lugar transparentamos
Se realizará sumergiendo la tira en un baño de metanol durante 1 minuto y a continuación a un baño de 2-3 minutos en las soluciones transparentadoras , para finalmente extenderlas en una placa de vidrio y sin burbujas , llevarlas a la estufa a 100-100 ºC hasta que estén totalmente transparentes . Una vez enfriadas , procederemos a la lectura por densitometría
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