PRÁCTICA Nº16 GRUPO SERICO

Fundamento.

Esta prueba se realiza con objeto de garantizar una prueba sanguínea correcta. Se confirma el grupo examinando el suero del individuo a tipificar con suspensiones de hematíes conocidos del grupo A y B. La forma habitual para su identificación es en tubo. 

Procedimiento.

1.-Rotular dos tubos de hemólisis A y B, con el número del paciente. 

2.-Colocar en cada tubo dos gotas de suero. 

3.-Añadir al tubo A, 1 gota de suspensión al 5% de hematíes conocidos del grupo A y al tubo B, 1 gota de suspensión al 5% de hematíes conocidos del grupo B. 

4.-Mezclar por agitación suave. 

5.-Centrifugar durante uno o dos minutos a 150 g. 6.-Rotar o agitar los tubos para desprender el botón celular, determinar el grupo sanguíneo si hay aglutinación o no. 

Resultados.

 -Si hay aglutinación en el tubo con hematíes A significa que ese suero tiene Ac. anti-A, luego es del grupo B.

 -Si hay aglutinación en el tubo con hematíes B significa que ese suero tiene 

En nuestro caso  presenta aglutinación y nos quiere decir que se trata del grupo O .

PRÁCTICA Nº 15 PT

Fundamento.

El tiempo de protombina es una etapa o tiempo de Quick , es una técnica de "screening" muy útil para detectar deficiencias del sistema extrínseco de la coagulación (factores I ,II , VII y X ).

Se utiliza habitualmente para monotorización de las terápias con anticoagulantes.

Objetivo.

Comprobar el tiempo de coagulación obtenido al añadir un plasma con exceso de protombina hística y calcio mediante el coagulómetro.

Materiales y reactivos.

-Baño maría a 37 ºC .

-Tubos de hemólisis y pipetas .

-Coagulómetro .

-Plasma control .

-Mezcla de trombloplastina con cloruro cálcico .

-Plasma obtenido por punción venosa en solución de citrato sódico 3,8% .

Procedimiento.

-En primer lugar , calentar la muestra y el RT (Tromboplastina cácica) a 37 ºC

-En segundo lugar mezclar el RT y pipetear 200 microlitros en la cubeta del coagulómetro.

-Incubar a 37 ºC durante 5 minutos y pipetear el plasma citratado (100 microlitros ).

-Poner en marcha el cronómetro y medir el tiempo de formación del coágulo .

Cálculos y resultados.

Tiempo de coagulación: 13.1 segundos.

Valores normales:

           PT (segundos): 13-17 segundos.

           PT (porcentaje): 70-120%.

           PT (tasa): 0.9-12

PRÁCTICA N º14 ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA

Fundamento.

La electroforesis de la hemoglobina es una técnica muy sencilla que permite detectar las anomalías tanto cualitativas como cuantitativas , la separación de las hemoglobinas se basa en las propiedades de la carga eléctrica de la globina .

La globina presenta una carga global positiva o negativa que resulta de la suma de las cargas de los aminoácidos que constituyen la proteína.

Objetivo.

El objetivo de la práctica es realizar una electroforesis con tiras de cellogel mediante un hemolizado.

Materiales y reactivos.

-Material de electroforesis .

-Cloroformo .

- Tampón tris-glicocola.

-Colorante negro amido .

-Colorante rojo Ponceau .

-Decolorante negro amido y rojo Ponceau.

-Solución transparentadora A y B.

-Solución disolvente (ácido acético 80 % ).

-Muestra de sangre anticoagulada con EDTA.

Procedimiento.

-En primer lugar realizaremos el hemolizado : centrifugaremos a 3.000 rpm durante 5 minutos , eliminamos el plasma , volvemos a resuspender los glóbulos rojos con 4-5 l de suero fisiológico y agitamos. Volvemos a centrifugar durante 5 minutos (repetiremos este paso 4 veces). A continuación , se hemolizan los hematíes en un tubo de vidrio mezclando 1 volumen de globulos rojos con 1.5 volúmenes de agua destilada junto con 0.5 volúmenes de cloroformo . Agitamos fuertemente y centrifugamos 20 minutos a 3.000 rpm 

El sobrenadante es el hemolizado que se emplea en la técnica .

-En segundo lugar prepararemos la electroforesis 

Sumergimos las tiras en tampón durante 10 minutos.

Absorbemos el exceso de tampón entre 2 hojas de papel de filtro.

Colocar la tira en el puente con la cara absorbente hacia arriba y la esquina cortada hacia la derecha y abajo.

Realizar la migración a 90 minutos a 200 volts efectuando la aplicación de la muestra a 1.5 cm del borde catódico.

-En tercer lugar realizaremos la coloración sumergiendo la tira en el colorante rojo Ponceau durante 10 minutos.

-En cuarto lugar , decoloramos mediante 3 o 4 baños en el decolorante hasta obtener un fondo completamente blanco.

-En quinto lugar transparentamos 

Se realizará sumergiendo la tira en un baño de metanol durante 1 minuto y a continuación a un baño de 2-3 minutos en las soluciones transparentadoras , para finalmente extenderlas en una placa de vidrio y sin burbujas , llevarlas a la estufa a 100-100 ºC hasta que estén totalmente transparentes . Una vez enfriadas , procederemos a la lectura por densitometría

IMAGENES:

PRÁCTICA 13: HIERRO.

FUNDAMENTO:

El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil. El hierro libre se reduce a ión ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado.

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hierro en la muestra ensayada1,2.

MATERIALES:

Espectofotómetro

Tubos de ensayo

Cubetas

Micropipetas

REACTIVOS:

MUESTRA:

Suero.

TÉCNICA:

Pipetear en una cubeta:

Mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente.

Condiciones del ensayo:

Longitud de onda (562 nm)

Cubeta 1 cm de paso de luz

Tª 37 ºC/ 15-25 ºC

Ajustar el espectofotómetro a cero frente a agua destilada.

Leer las absorbancias (A) del patrón y la muestra frente al blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 min.

RESULTADOS:

Al medir la absorbancia en el espectrofotómetro:

Blanco = 0

Patrón =0.076

Muestra = 0.098

0.098/ 0.323 X 100 =128.94 

SIGNIFICADO CLÍNICO:

El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.

El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas1,5,6.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

PRÁCTICA Nº 12 HEMOGLOBINA

FUNDAMENTO

La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada1,2 .

.MATERIALES:

Reactivo de trabajo

Calibrador

Espectrofotómetro

Cubetas

Micropipetas

REACTIVOS

Reactivo de Drabkin (ferricianuro  de potasio , cianuro de potasio y dihidrogeno fosfato de potasio)

MUESTRA:

Sangre venosa, es recomendable usar anticoagulante EDTA, heparina u oxalato

PROCEDIMIENTO:

-En primer lugar prepararemos nuestro reactivo de trabajo (RT) , para ello mezclaremos 5 ml de agua destilada con 2 gotas de reactivo de Drabkin.

-En segundo lugar procederemos a vertir en tubos de ensayo de plástico un blanco con 2.5 ml de reactivo de trabajo , 2.5 ml de reactivo de trabajo + 10 microlitros de patrón en otro tubo y 2.5 de reactivo de trabajo con 10 microlitros de muestra problema .

-En tercer lugar incubamos a temperatura ambiente durante 3 minutos , posteriormente pasaremos las sustancias a 3 cubetas de espectofotometría diferentes .

-En cuarto lugar mediremos la absorbancia frente al blanco a 540 nm en el espectofotómetro .

RESULTADOS:

Al medir la absorbancia en el espectrofotómetro:

Blanco = 0

Patrón = 0.323

Muestra = 0.351

0.351/ 0.323 X 15 = 16,30 g/dL

SIGNIFICADO CLÍNICO:

La hemoglobina es una proteína que contiene hierro, otorga el color rojo a la sangre. Se encuentra en los glóbulos rojos y es la encargada del transporte de oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cáncer, embarazo, enfermedades renales o hemorragias. Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatías, deshidratación o estancia en lugares de gran altitud1,5,6.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

PRACTICA Nº11 FRAGILIDAD OSMOTICA ERITROCITARIA

Fundamento.

-La resistencia osmotica eritrocitaria es una tecnica realizada para el estudio de las membranopatias eritrocitarias.

-Debido a su forma bicóncava, los eritrocitos pueden aceptar, sin producir hemólisis, una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta un 70%. Una vez rebasado este límite, sobreviene la hemólisis

Material y reactivos.

-Solución madre de NaCl de 50 g/L en agua bidestilada .

-Soluciones de trabajo .

-Muestra de sangre total .

-Tubos de centrífuga .

-Espectofotómetro .

-Centrífuga .

-Papel milimetrado .

Procedimiento.

1.A partir de la solución madre preparamos las siguientes soluciones de trabajo.

-Solución 1 (1 G/L de NaCl) : 1 mL sol. madre + 99 mL de agua bidestilada .

-Solución 2 (3 G/L de NaCl) : 3 mL sol. madre + 97 mL de agua bidestilada .

-Solución 3 (4 G/L de NaCl) : 4 mL sol. madre + 96 mL de agua bidestilada .

-Solución 4 (5 G/L de NaCl) : 5 mL sol. madre + 95 mL de agua bidestilada .

-Solución 5 (6 G/L de NaCl) : 6 mL sol. madre + 94 mL de agua bidestilada .

-Solución 6 (8 G/L de NaCl) : 8 mL sol. madre + 92 mL de agua bidestilada .

-Solución 7 (10 G/L de NaCl) : 10 mL sol. madre + 90 mL de agua bidestilada .

2.Colocamos 5 mL de cada solución en una batería de tubos de centrífuga .

3.Añadimos 25 microlitros de sangre total y agitamos y dejamos a temperatura ambiente durante 45-60 minutos.

4.Se centrifuga a 3000 rpm durante 10 minutos y separamos el sobrenadante (una vez incubado).

5.Medimos el grado de hemólisis del sobrenadante en un espectofotómetro a una longitud de onda de 540 nm sonsiderando el rubo con 1 g/L de NaCl como el 100% de hemólisis y el de 10 g/L de NaCl como el blanco (0% de hemólisis)

6.Finalmente representamos en un papel milimetrado en abscisas los g/L de NaCl  , y en ordenadas el porcentaje de hemólisis de los diferentes tubos , por interpolación se determinan cuál es la concentración de NaCl necesaria para producir una hemólisis del 50 % (H50) , siendo ese valor equivalente a la FOE

                                        RESULTADOS:
       

PRÁCTICA Nº10

Fundamento.

La velocidad de sedimentación globular , eritrocitaria o eritro sedimentación , mide la precipitación o sedimento de los hematíes en un tiempo determinado.

Objetivo.

Con una muestra de sangre total citratada al 3,8% , realizar la prueba VSG en el tiempo de 1 hora.

Materiales y reactivos.

-Muestra de sangre citratada al 3,8% .

-Pipeta de Westergren .

-Soporte para VSG .

Procedimiento.

La prueba se realizará a temperatura ambiente , ya que la temperatura influye en la velocidad de la técnica.

1- Se mezcla suavemente la sangre y el anticoagulante contenido en el tubo, haciendo inversiones suaves.

2- Situamos el tubo mezclador en una de las perforaciones de la base de la gradilla para VSG.

3- Se introduce la pipeta de VSG a través de las perforaciones le la gradilla presionamos con la pipeta sobre el tapón del tubo hasta que su punta lo perfore y alcance el fondo del tubo, llenar la pipeta con la ayuda del  embolo que tiene cada una de ellas.

4- Dejar reposar la sangre durante 1 hora apuntando los mm que ha bajado la columna de hematíes.

Cálculos y resultados.

Hemos realizado la prueba midiendo a 1 y a 2 horas
-VSG a 1 hora = 10 mm
-VSG a 2 horas = 20 mm 

Realizando el Índice de Katz = (VSG(1ºhora) + VSG(2ªhora)/ 2) / 2
Nos da un resultado de 10 mm.
Los valores de normalidad oscilan entre menos de 15 mm/h en hombres ( muestra sanguínea de varón) y 20 mm/h en mujer .
Con lo cual la persona está dentro de los valores de normalidad