PRÁCTICA Nº18 test de coombs
Fundamento.
Se le llama también prueba de la antiglobulina indirecta (PAI). Sirve para la determinación de Anti-D, Ig G incompletos en plasma o suero. Se hace a madres Rh - que pueden estar sensibilizadas por incompatibilidad Rh materno-fetal o por transfusión incompatible.
En un primer tiempo se ponen en contacto hematíes con antígeno D con el plasma problema. Si existen anti-D en dicho plasma, se produce la unión aunque no la aglutinación. Tras incubar, se añade la antiglobulina . Ésta hace de puente de unión entre complejos Ag-Ac y se visualiza la aglutinación.
Reactivos.
Para está prueba necesitaremos suero o plasma de la paciente de la que se pretende averiguar si está o no sensibilizada con anticuerpos anti-D.
Procedimiento.
a) Preparación de los hematíes de especificidad conocida. En este caso, hematíes con el antígeno D y del grupo O para evitar aglutinación por este sistema. Si no se dispone de estos hematíes, se utiliza sangre del sistema ABO compatible con la muestra problema.
-Lavar los hematíes con solución salina isotónica, 2-3 veces. Centrifugar 4-5 minutos a 1.000 g y decantar el sobrenadante (en el último lavado, eliminarlo al máximo).
-Preparar una suspensión de hematíes del 5% (0,1 ml de concentrado de hematíes lavados + 1,9 ml de solución salina isotónica).
b) Preparar en tres tubos centrífuga rotulados, tres controles como se indica: -Control negativo: 2 gotas anti-D + 2 gotas de suspensión de hematíes Rh negativos al 5 por 100.
-Control positivo: 2 gotas anti-D (diluido a 1/10 con solución salina isotónica) + 2 gotas de suspensión de hematíes Rh positivos al 5 por 100. -Control de solución salina: prepararlo en principio como un control negativo.
c) En el tubo problema echar 2 gotas del suero problema + 2 gotas de suspensión de hematíes O + preparados en el punto a.
d) Mezclar e incubar a 37º C de 30-60 minutos. En este tiempo, si en el suero hay anticuerpos anti-D incompletos, se unen al hematíe D pero no consiguen la aglutinación.
e) Lavar de nuevo con solución salina fisiológica 3 veces. La razón del lavado está en eliminar del tubo cualquier resto de globulinas procedentes del suero problema o del plasma en la suspensión de hematíes. Sólo deben quedar en el tubo: los hematíes, si la prueba es negativa, o los hematíes recubiertos con los anticuerpos que buscamos.
f) Añadir 2 gotas del suero antiglobulina humana al tubo problema (suero poliespecífico contra cualquier tipo de globulinas humanas). Por esto son tan importantes los lavados, ya que cualquier resto de globulinas puede unirse al suero antiglobulínico, gastándose en estas uniones y no en el anticuerpo unido al hematíe. Tendríamos así falsos negativos. Se puede usar un suero algo más específico anti-lgG humano, pero el lavado sigue siendo imprescindible para eliminar todas las IgG libres.
g) Añadir también dos gotas de antiglobulina humana a los tubos controles + y - y añadir dos gotas de solución salina isotónica al tubo control de la solución salina. Este tubo no debe aglutinar.
h) Mezclar suavemente. Esperar 1-2 minutos a temperatura ambiente.
i) Centrifugar los cuatro tubos 1 minuto a 150 g.
j) Levantar el sedimento con pequeños golpes. Si la suspensión es homogénea en el tubo problema, la prueba es negativa. Si hay aglutinación de los hematíes, la prueba es positiva. En este caso se hacen diluciones del suero: 1/2, 1/4, 1/8, etc, y se repite la prueba. El título es el denominador de la última dilución que aglutina. El control + debe aglutinar y no deben aglutinar los controles - y de la solución salina.
RESULTADOS:
Contiene
anti-D (aglutinado), por lo tanto, prueba positiva = hay Ac,
los hematíes están
sensibilizados
